2021 年，因中国科学院院士高福大声疾呼，mRNA 疫苗一夜之间名声鹊起，成为人们在新型冠状病毒肆虐期间的希望。如今，那段特殊过往已成历史，但 mRNA 疫苗背后的 RNA 修饰却仍在以日新月异的速度向前发展。
所谓 RNA 修饰，是一类重要转录后调控方式，能够广泛参与各种 RNA 转录后的加工代谢途径。
RNA 修饰之所以值得被关注，还因其在真核生物生长发育过程中发挥了至关重要的生物学功能。 例如，近年研究发现，N⁶-甲基腺苷 (m⁶A) 在哺乳动物胚胎干细胞中的去稳定化作用与多种疾病相关，5-甲基胞嘧啶 (m⁵C) 与水稻对高温的耐受性有关。
不过，RNA 具有多种类型的修饰，迄今为止，自然界 RNA 中被发现的修饰类型已超过 160 种。此前，由牛津纳米孔科技有限公司 (Oxford Nanopore Technologies, ONT) 开发的纳米孔直接 RNA 测序 (Direct RNA Sequencing, DRS) 技术，结合深度学习方法，可以实现单个碱基的修饰识别，但该方法难以在单个样本中同时检测多种修饰类型。
针对以上问题，上海交通大学生命科学技术学院长聘教轨副教授余祥课题组，联合上海辰山植物园杨俊 / 王红霞团队，在「Nature Communications」发表了题为「Transfer learning enables identification of multiple types of RNA modifications using nanopore direct RNA sequencing」的研究论文，开发了可迁移深度学习模型 TandemMod，实现了在 DRS 中鉴定多种类型的 RNA 修饰。
研究亮点：
- 在保证同等性能的条件下，显著减少训练集数据量和模型训练时间等计算成本
- TandemMod 为动植物和微生物体内，多种类型的 RNA 修饰位点鉴定及表观转录组研究，提供重要技术支撑
- TandemMod 还可用于检测 RNA 疫苗等人工修饰的 RNA
论文地址：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-48437-4
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数据集：多重数据集针对性训练
为了训练、评估 TandemMod 模型性能，研究团队采用了多组数据集进行实验。
首先，研究团队利用 Nookaew 实验室生成的体外转录数据集 ELIGOS， 计算了 6 种修饰碱基 (m¹A、m⁶A、m⁵C、hm⁵C、m⁷G、Ψ) 的 5 个基级特征 （均值、中位数、标准差、信号长度和碱基质量），并与未修饰的碱基进行了比较。
其次，研究团队选择基于真核 mRNA 中最常见的两种修饰 m⁵C 和 m⁶A，研究 TandemMod 的性能。研究人员在 Curlcake 数据集上训练了 TandemMod m⁵C 模型， 该数据集来自包含所有可能的 5-mers 的体外转录序列，并按 4:1 的比例分为训练集和测试集。
利用水稻cDNA文库体外转录带有m¹A、m⁶A、m⁵C标签的转录本、并通过DRS创建体外表观转录组的示意图
同时，为解决体外合成序列转录的 RNA 无法覆盖自然序列全部范围的问题，研究团队对含有 T7 启动子的水稻 cDNA 文库进行体外转录，得到了具备不同修饰标签的数千个转录本，加 polyA 尾后通过 DRS 构建了 4 个训练集 (m¹A、m⁶A、m⁵C 和未修饰碱基)，称为体外表观转录组数据集 (IVET)。
模型架构：一种深度学习框架
以此为基础，研究团队以每 5 个碱基分配到的电信号及其统计特征作为输入，训练可同时检测多种 RNA 修饰类型的迁移学习模型 TandemMod。
基于DRS数据搭建TandemMod深度学习框架的示意图
如上图所示，TandemMod 由数据预处理 (Data preprocessing)、模型预训练 (Model pretraining) 和迁移学习 (Transfer learning) 组成。
其中，模型预训练由 4 个主要组件构成：
- 一维卷积神经网络 (1D-CNN)，用于提取原始电流强度信号的局部特征；
- 双向长短期记忆模块 (Bi-LSTM)，用于捕获相邻信号之间的长期相关性，提升更长过程中上下文的理解能力；
- 注意力机制 (Attention)，用于加权每个特征在不同时间不长的重要性，提升模型对于重要信号的捕捉能力；
- 全连接层 (full-connected layers) 的分类器，负责根据所有特征的组合信息进行预测。
此外，为了验证迁移学习能否应用于 DRS 数据，以实现对多种类型 RNA 修饰的检测，研究人员在 IVET m5C 数据集上训练了 TandemMod，得到了一个预训练模型 (Pretrained model)。 在 TandemMod 模型中，顶层充当特征提取器，底层充当分类器。研究人员冻结 (froze) 了预训练模型的顶层，并在 ELIGOS 训练集 (hm5C、m7G、Ψ 和 I) 上重新训练了底层，以尽量减少分类误差。
迁移学习检测m⁷G、hm⁵C、Ψ和I多种类型RNA修饰位点的性能评估曲线
经过 2 个周期，所有模型都达到了高准确度， hm⁵C、m⁷G、Ψ 和 I 的 ROC-AUC 分别达到了 0.98、0.95、0.96 和 0.97。如上图 a、b、c、d 所示。
实验结果：TandemMod 显著减少训练集数据量和模型训练时间
实验阶段，研究团队将 TandemMod 模型与经典机器学习算法进行了比较来评估其性能，比较对象分别为 XGBoost、support vector machine (SVM) 和 k-nearest neighbor (KNN)。在 Curlcake 测试数据集 m⁶A 识别的情况下，TandemMod 以 0.90 的准确率优于其他算法。 同样，对于 m⁵C 的识别，TandemMod 准确率达到 0.95，这一比较突出了 TandemMod 在使用 DRS 数据识别修改方面的有效性。
在识别体内不同修饰率水平的样本方面，TandemMod 相较 tombo 和 xPore 也显示出了更好的优越性。这表明 TandemMod 不需要阴性对照样本就可以准确预测不同修饰率的样本。
TandemMod与其他基于DRS的主流算法预测m⁶A修饰位点的比较
此外，研究团队还将 TandemMod m⁶A 模型与 tombo、nanom6A 和 m6Anet进行了比较，如上图所示。
在 ELIGOS rash (R-A 或 G, H-A,或 C 或 U) 基序上，TandemMod、nanom6A 和 tombo 的 ROC-AUC 分别为 0.96、0.88 和 0.52。在 ELIGOS DRACH (D-A, G，或 U) 基序上，TandemMod、m6Anet 和 tombo 的 ROC-AUC 分别为 0.95、0.71 和 0.64。
这些结果表明，使用体外 DRS 数据集进行训练，TandemMod 在现有工具中提供了最准确的读取水平预测。
研究团队验证了 TandemMod m⁵C 模型在 m⁶A 检测中，迁移学习的分类性能、所需训练数据和计算资源利用率，并与标准实例的 TandemMod m⁶A 模型进行了比较。结果表明，迁移学习可在保证同等性能的条件下，显著减少训练集数据量和模型训练时间等成本。
通过TandemMod绘制高盐胁迫下水稻m⁶A、m⁵C和Ψ的表观修饰图谱
最后，研究团队检验了 TandemMod 模型推广到新物种进行 DRS 数据测序的能力，使用人类细胞系（2 个修饰酶敲除样本和 5 个野生型样本）进一步验证了 TandemMod 的可靠性。同时，研究团队还通过 TandemMod 绘制了水稻幼苗在高盐胁迫下 m⁶A、m⁵C 和 Ψ 的表观修饰图谱，并揭示了 mRNA 中 m⁶A 和 m⁵C 的共修饰及其在高盐环境下的修饰率变化。如上图所示。
RNA 修饰开启生命探索的新大门
古往今来，人们对于生命的探索从未停止。而在 RNA 世界假说提出后，RNA 作为生命起源的论调无疑成为当前最让人信服的答案之一。自 1960 年第一个 RNA 修饰被发现以来，其就早已成为科研界探索的重中之重，在近年的研究中仍保持着极高的关注度。
除了本论文余祥课题组以及杨俊 / 王红霞团队，以及文中所提到的 ONT 公司外，还有更多的团队和企业也在进行RNA 修饰研究。
例如，在 2021 年，西交利物浦大学孟佳教授团队在「Nature Communications」期刊上发表了题为「Attention-based multi-label neural networks for integratedprediction and interpretation of twelve widely occurring RNA modifications」的文章。
论文地址： https://www.nature.com/articles/s41467-021-24313-3
文中提到了一种基于注意力机制的多标签深度学习框架的模型 MultiRM， 不仅可以同时预测 12 个广泛存在的转录组位点，而且对预测过程中的关键序列进行了提取分析，揭示了不同类型的 RNA 修饰之间有很强的关联，有助于更好的综合分析和理解基于序列的 RNA 修饰机制。
无独有偶，「Nature Biotechnology」于 2021 年收录的一篇名为「Identification of differential RNA modifications from nanopore direct RNA sequencing with xPore」的论文中，研究团队利用 xPore 从 Direct RNA-seq 数据中高精度鉴定 RNA 修饰，并从单次高通量实验中分析差异修饰和表达。
论文地址： https://www.nature.com/articles/s41587-021-00949-w
这些研究正在帮助我们进一步推开 RNA 世界的大门，从而让我们进一步探索「生命的真谛」。虽然目前各项研究的进展仍有大量的瓶颈需要突破，但「先驱者」不断地挑战早已让 RNA 研究的大门越发敞亮。
参考资料：
1. https://news.sjtu.edu.cn/jdzh/2
